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時(shí)間：2020-10-20 09:18:12
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編輯：乙肝新聞
乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)在維持乙型肝炎病毒(HBV)的持續(xù)存在和促進(jìn)乙肝病毒誘導(dǎo)的肝細(xì)胞肝癌維持干細(xì)胞特性（stemness）、侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制中扮演著重要角色。
GautamBuddha大學(xué)等研究機(jī)構(gòu)的研究人員在2020美國(guó)肝病學(xué)會(huì)年會(huì)（AASLD2020）上發(fā)表了一項(xiàng)利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)設(shè)計(jì)并合成了一種HBx基因特異性的小引導(dǎo)RNA(SgRNA)，并在體外研究該小引導(dǎo)RNA(SgRNA)對(duì)HBV基因組整合肝癌細(xì)胞的HBx表達(dá)、HBsAg水平以及干細(xì)胞和上皮間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化(EMT)特性的影響的研究。
研究人員首先在基于硅的工具上使用CRISPORweb設(shè)計(jì)出具有最小脫靶錯(cuò)配的針對(duì)HBx的sgRNA，然后通過克隆到非病毒eSpCas9-2A-Puro（PX459）V20載體（HBx-CRISPR）中進(jìn)行開發(fā)。
在體外，通過基于脂質(zhì)的轉(zhuǎn)染方法，用HBx-CRISPR或?qū)φ蛰d體（PX459）轉(zhuǎn)染HepG2-215（表達(dá)HBV的穩(wěn)定肝癌細(xì)胞）。通過免疫熒光，集落形成，HBsAgELISA和實(shí)時(shí)PCR評(píng)估了新設(shè)計(jì)的HBx-CRISPR的效率和效果。
研究人員使用設(shè)計(jì)的HBx-CRISPR切除了全長(zhǎng)465bp的HBx基因，導(dǎo)致96小時(shí)后HepG2-2.15細(xì)胞中HBx基因表達(dá)的顯著敲低（降低18倍，p<0.01圖1A）。ELISA分析表明，經(jīng)過96小時(shí)后，HBx-CRISPR處理使細(xì)胞上清液中的HBsAg水平降低了50％。
與用對(duì)照載體（p<0.05，圖1B-C）和pGFP-HBx（p<0.01，圖B-C）轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比，用HBx-CRISPR處理的細(xì)胞還表現(xiàn)出形成的細(xì)胞集落數(shù)量顯著減少。免疫熒光研究表明，與對(duì)照轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比，在HBx-CRISPR處理的細(xì)胞中上皮蛋白CDH1（E-鈣粘蛋白）的表達(dá)增強(qiáng)，而間充質(zhì)蛋白VIM（波形蛋白）的表達(dá)降低（圖D）。
在基因表達(dá)研究中，與對(duì)照組和pGFP-HBx轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比，經(jīng)HBx-CRISPR處理的細(xì)胞VIM基因顯著降低(p<0.05，圖E)，而CDH1基因顯著上調(diào)(p<0.01，圖F)。
綜上研究表明，研究認(rèn)為新型CRISPR/CAS9系統(tǒng)靶向HBx能有效降低HBV-HCC細(xì)胞的HBx基因表達(dá)、HBsAg水平以及細(xì)胞的干性和間質(zhì)特性。這項(xiàng)研究代表了一種有效的控制乙肝病毒誘導(dǎo)的腫瘤進(jìn)展的非病毒治療方法。（更多肝病新藥研究信息敬請(qǐng)關(guān)注“肝臟時(shí)間”微信公眾號(hào)）！
信息源：
TARGETINGHBxBYCRISPR/Cas9SYSTEMEFFECTIVELYREDUCESTHEEMTANDSTEMNESSCHARACTERISTICSOFHCCCELLSINVITRO.
第21屆亞太肝臟研究學(xué)會(huì)年會(huì)報(bào)道
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