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時間：2023-02-14 10:15:00
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編輯：乙肝新聞
編者按：目前HBV感染仍是全球重要的公共衛生問題。牛磺膽酸鈉共轉運多肽（NTCP）是HBV進入肝細胞所需的受體之一。HBV進入肝細胞后形成共價閉合環狀DNA（cccDNA），cccDNA半衰期較長，無需新的病毒進入肝細胞即可自我補充，保持一定數量的轉錄模板。因此，抑制HBV進入肝細胞在預防HBV感染中至關重要。
早前日本研究團隊已證實了在聚乙二醇干擾素α（PEG IFNα）治療期間，血清miR-6126水平的升高預示著HBsAg的降低，且體外實驗也說明了miR-6126能夠抑制HBsAg的產生和HBV復制。這表明miR-6126具有抑制HBV病毒活性的潛力，但潛在機制尚不清楚。
近期，該研究團隊的最新成果發表在Gene上，通過體外實驗探索miR-6126是否下調了NTCP的表達水平，結果顯示：轉染miR-6126降低了HepG2-NTCP細胞中NTCP的表達水平，且miR-6126下調了NTCP mRNA的表達，這與miR-6126抑制HBV進入肝細胞有關。
研究方法
HepG2-NTCP細胞是過表達牛磺膽酸鈉共轉運多肽（NTCP）-1的肝癌細胞株，用于評估轉染miR-6126后NTCP的表達水平和PreS1附著在NTCP上的情況。TaqMan基因表達分析用于檢測NTCP和β-肌動蛋白（β-actin）的基因表達水平。Western blot分析和免疫染色法評估NTCP蛋白表達水平。
人原代肝細胞PXB細胞從接種PHH的尿激酶型纖溶酶原激活物轉基因/SCID小鼠中分離出來，用于驗證miR-6126對PreS1附著在NTCP的抑制作用。酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測培養上清液中HBsAg水平，以評估HBV進入肝細胞的減少程度。
評估NTCP mRNA的穩定性，以確定NTCP mRNA下調的原因。計算治療組和對照組之間miRNA表達水平的差異倍數。
研究結果
01 miR-6126抑制了NTCP表達和PreS1抗原附著于細胞表面
Western blot分析表明在HepG2-NTCP細胞中50 nm的miR-6126抑制了NTCP表達，而50 nm的miR-6126抑制劑會增強NTCP表達水平。免疫染色法也表明了50 nm的miR-6126抑制了NTCP表達。基于胞漿的面積比例，NTCP染色的面積隨miR-6126轉染而顯著降低。
轉染miR-6126后HepG2-NTCP細胞和人原代肝細胞PXB細胞中PreS1抗原對細胞表面的附著下降。
圖1：Western blot分析（A）和免疫染色法（B）評估NTCP表達水平
02 miR-6126降低了NTCP mRNA的穩定性及HBsAg水平
在HepG2-NTCP細胞中，通過放線菌素D（5 μg/mL）抑制mRNA合成，miR-6126轉染組的NTCP殘留mRNA的下降比陰性對照組更快。
在PXB細胞中，miR-6126轉染組的HBsAg水平顯著低于陰性對照組。
圖2：miR-6126轉染組與陰性對照組的NTCP mRNA穩定性和HBsAg水平
03 miR-6126引起轉錄組變化和miRNA表達譜改變，下調了NTCP mRNA的表達水平
在NTCP的3'UTR、5'UTR和CDS序列中，使用miRNA目標序列motif來搜索，均未發現miR-6126可能的靶點。
在HepG2-NTCP細胞中轉染miR-6126后，與陰性對照相比，4個mRNAs表達水平上調，25個mRNAs表達水平下調。轉錄組數據已上傳NCBI數據庫（登錄號：GSE192617）。
圖3：miR-6126轉染24小時后的轉錄組分析
miRNAs微陣列分析表明miR-6126等9個miRNAs上調，7個miRNAs下調。miRNA芯片數據已上傳NCBI數據庫（登錄號：GSE180543）。
圖4：miR-6126轉染24小時后的miRNAs微陣列分析
肝霖君有話說
本研究發現HepG2-NTCP細胞轉染miR-6126后NTCP的表達水平下調、并且miR-6126通過降低NTCP mRNA穩定性從而下調其mRNA水平。PXB細胞轉染miR-6126后PreS1抗原附著于細胞表面減少，且HBsAg水平顯著下降。這表明miR-6126可通過下調NTCP，抑制HBV進入肝細胞，從而減少cccDNA合成。而之前的研究已顯示在聚乙二醇干擾素α治療期間，血清miR-6126水平的升高預示著HBsAg的降低。
已有多項研究也對干擾素α清除cccDNA的機制進行了探索，郭巨濤教授團隊發現干擾素α可通過誘導募集到cccDNA微染色體上的三種細胞蛋白來改變組蛋白翻譯后修飾，并協同抑制cccDNA轉錄（相關鏈接）。寧琴教授團隊揭示IFNα可通過介導細胞外泌體miRNA清除cccDNA（相關鏈接）。張曉東教授團隊發現干擾素α可抑制cccDNA上GCN5介導的組蛋白琥珀酰化作用從而通過表觀遺傳調控來清除cccDNA（相關鏈接）。目前基于聚乙二醇干擾素α的治療策略可提升慢乙肝臨床治愈率，對其作用機制的深入探索研究將有助于進一步優化治療方案，推進治愈率的進一步提升。
參考文獻：
Fujita K, Nishitsuji H, Iwama H, et al. Pegylated interferon therapy-related microRNA-6126 downregulates sodium taurocholate cotransporting polypeptide expression in hepatocytes [J]. Gene, 2022, 22: 147068
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