【期刊導(dǎo)讀】聚乙二醇干擾素α治療期間miR

編者按：目前HBV感染仍是全球重要的公共衛(wèi)生問題。牛磺膽酸鈉共轉(zhuǎn)運(yùn)多肽（NTCP）是HBV進(jìn)入肝細(xì)胞所需的受體之一。HBV進(jìn)入肝細(xì)胞后形成共價閉合環(huán)狀DNA（cccDNA），cccDNA半衰期較長，無需新的病毒進(jìn)入肝細(xì)胞即可自我補(bǔ)充，保持一定數(shù)量的轉(zhuǎn)錄模板。因此，抑制HBV進(jìn)入肝細(xì)胞在預(yù)防HBV感染中至關(guān)重要。

早前日本研究團(tuán)隊已證實(shí)了在聚乙二醇干擾素α（PEG IFNα）治療期間，血清miR-6126水平的升高預(yù)示著HBsAg的降低，且體外實(shí)驗(yàn)也說明了miR-6126能夠抑制HBsAg的產(chǎn)生和HBV復(fù)制。這表明miR-6126具有抑制HBV病毒活性的潛力，但潛在機(jī)制尚不清楚。

近期，該研究團(tuán)隊的最新成果發(fā)表在Gene上，通過體外實(shí)驗(yàn)探索miR-6126是否下調(diào)了NTCP的表達(dá)水平，結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染miR-6126降低了HepG2-NTCP細(xì)胞中NTCP的表達(dá)水平，且miR-6126下調(diào)了NTCP mRNA的表達(dá)，這與miR-6126抑制HBV進(jìn)入肝細(xì)胞有關(guān)。

研究方法

HepG2-NTCP細(xì)胞是過表達(dá)牛磺膽酸鈉共轉(zhuǎn)運(yùn)多肽（NTCP）-1的肝癌細(xì)胞株，用于評估轉(zhuǎn)染miR-6126后NTCP的表達(dá)水平和PreS1附著在NTCP上的情況。TaqMan基因表達(dá)分析用于檢測NTCP和β-肌動蛋白（β-actin）的基因表達(dá)水平。Western blot分析和免疫染色法評估NTCP蛋白表達(dá)水平。

人原代肝細(xì)胞PXB細(xì)胞從接種PHH的尿激酶型纖溶酶原激活物轉(zhuǎn)基因/SCID小鼠中分離出來，用于驗(yàn)證miR-6126對PreS1附著在NTCP的抑制作用。酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測培養(yǎng)上清液中HBsAg水平，以評估HBV進(jìn)入肝細(xì)胞的減少程度。

評估NTCP mRNA的穩(wěn)定性，以確定NTCP mRNA下調(diào)的原因。計算治療組和對照組之間miRNA表達(dá)水平的差異倍數(shù)。

研究結(jié)果

01 miR-6126抑制了NTCP表達(dá)和PreS1抗原附著于細(xì)胞表面

Western blot分析表明在HepG2-NTCP細(xì)胞中50 nm的miR-6126抑制了NTCP表達(dá)，而50 nm的miR-6126抑制劑會增強(qiáng)NTCP表達(dá)水平。免疫染色法也表明了50 nm的miR-6126抑制了NTCP表達(dá)。基于胞漿的面積比例，NTCP染色的面積隨miR-6126轉(zhuǎn)染而顯著降低。

轉(zhuǎn)染miR-6126后HepG2-NTCP細(xì)胞和人原代肝細(xì)胞PXB細(xì)胞中PreS1抗原對細(xì)胞表面的附著下降。

圖1：Western blot分析（A）和免疫染色法（B）評估NTCP表達(dá)水平

02 miR-6126降低了NTCP mRNA的穩(wěn)定性及HBsAg水平

在HepG2-NTCP細(xì)胞中，通過放線菌素D（5 μg/mL）抑制mRNA合成，miR-6126轉(zhuǎn)染組的NTCP殘留mRNA的下降比陰性對照組更快。

在PXB細(xì)胞中，miR-6126轉(zhuǎn)染組的HBsAg水平顯著低于陰性對照組。

圖2：miR-6126轉(zhuǎn)染組與陰性對照組的NTCP mRNA穩(wěn)定性和HBsAg水平

03 miR-6126引起轉(zhuǎn)錄組變化和miRNA表達(dá)譜改變，下調(diào)了NTCP mRNA的表達(dá)水平

在NTCP的3'UTR、5'UTR和CDS序列中，使用miRNA目標(biāo)序列motif來搜索，均未發(fā)現(xiàn)miR-6126可能的靶點(diǎn)。

在HepG2-NTCP細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-6126后，與陰性對照相比，4個mRNAs表達(dá)水平上調(diào)，25個mRNAs表達(dá)水平下調(diào)。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)已上傳NCBI數(shù)據(jù)庫（登錄號：GSE192617）。

圖3：miR-6126轉(zhuǎn)染24小時后的轉(zhuǎn)錄組分析

miRNAs微陣列分析表明miR-6126等9個miRNAs上調(diào)，7個miRNAs下調(diào)。miRNA芯片數(shù)據(jù)已上傳NCBI數(shù)據(jù)庫（登錄號：GSE180543）。

圖4：miR-6126轉(zhuǎn)染24小時后的miRNAs微陣列分析

肝霖君有話說

本研究發(fā)現(xiàn)HepG2-NTCP細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-6126后NTCP的表達(dá)水平下調(diào)、并且miR-6126通過降低NTCP mRNA穩(wěn)定性從而下調(diào)其mRNA水平。PXB細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-6126后PreS1抗原附著于細(xì)胞表面減少，且HBsAg水平顯著下降。這表明miR-6126可通過下調(diào)NTCP，抑制HBV進(jìn)入肝細(xì)胞，從而減少cccDNA合成。而之前的研究已顯示在聚乙二醇干擾素α治療期間，血清miR-6126水平的升高預(yù)示著HBsAg的降低。

已有多項(xiàng)研究也對干擾素α清除cccDNA的機(jī)制進(jìn)行了探索，郭巨濤教授團(tuán)隊發(fā)現(xiàn)干擾素α可通過誘導(dǎo)募集到cccDNA微染色體上的三種細(xì)胞蛋白來改變組蛋白翻譯后修飾，并協(xié)同抑制cccDNA轉(zhuǎn)錄（相關(guān)鏈接）。寧琴教授團(tuán)隊揭示IFNα可通過介導(dǎo)細(xì)胞外泌體miRNA清除cccDNA（相關(guān)鏈接）。張曉東教授團(tuán)隊發(fā)現(xiàn)干擾素α可抑制cccDNA上GCN5介導(dǎo)的組蛋白琥珀酰化作用從而通過表觀遺傳調(diào)控來清除cccDNA（相關(guān)鏈接）。目前基于聚乙二醇干擾素α的治療策略可提升慢乙肝臨床治愈率，對其作用機(jī)制的深入探索研究將有助于進(jìn)一步優(yōu)化治療方案，推進(jìn)治愈率的進(jìn)一步提升。

參考文獻(xiàn)：

Fujita K, Nishitsuji H, Iwama H, et al. Pegylated interferon therapy-related microRNA-6126 downregulates sodium taurocholate cotransporting polypeptide expression in hepatocytes [J]. Gene, 2022, 22: 147068

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