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時(shí)間：2020-01-13 15:57:49
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編輯：乙肝新聞
全世界有超過2.5億的慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染者，鑒于慢性乙型肝炎患者之間存在很大的異質(zhì)性，目前尚缺乏有效的、安全的可實(shí)現(xiàn)功能性治愈慢乙肝的聯(lián)合療法。
為了實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，Spring Bank Pharmaceuticals 公司研究人員設(shè)計(jì)了一款可靶向所有HBV病毒轉(zhuǎn)錄物的新型嵌合反義寡核苷酸（CASOs），是通過將免疫調(diào)節(jié)劑二核苷酸SB9000（Inarigivir 的活性代謝物，Inarigivir 是一種口服的肝選擇性RIG-I激動(dòng)劑，目前正在慢乙肝患者中進(jìn)行全球Phase II期臨床試驗(yàn)。）跟可切割的連接體與反義寡核苷酸(ASO)進(jìn)行鏈接而成。
研究假設(shè)，這種將基因沉默和免疫調(diào)節(jié)相結(jié)合生成的嵌合反義寡核苷酸（CASOs）雙管齊下的方法可同時(shí)抑制 HBV DNA，RNA 和抗原產(chǎn)生，并在體內(nèi)激活RIG-I，從而在慢乙肝患者中實(shí)現(xiàn)由免疫介導(dǎo)的病毒清除。
研究人員（a）使用標(biāo)準(zhǔn)的亞磷酰胺化學(xué)方法合成了一系列具有糖基和堿基修飾，并且是可針對(duì) HBx RNA 不同區(qū)域的含有 8 至 20 個(gè)硫代磷酸酯的鏈接或沒有鏈接SB 9000的反義寡核苷酸(ASO)。
（b）為篩選熒光素酶報(bào)道基因，研究人員將HBx基因克隆到海腎和螢火蟲熒光素酶psiCHECK?-2雙重載體（Promega）中。將反義寡核苷酸(ASO)與質(zhì)粒一起轉(zhuǎn)染到Hepa 1-6細(xì)胞中，并在24小時(shí)后測(cè)量熒光素酶活性。
（c）使用標(biāo)準(zhǔn)方案測(cè)試反義寡核苷酸(ASO)的血清穩(wěn)定性和RNase H介導(dǎo)的互補(bǔ)RNA裂解。
抗HBV測(cè)定：（i）HepG2.2.15細(xì)胞：在脂質(zhì)轉(zhuǎn)染反義寡核苷酸(ASO)后，在HepG2.2.15 細(xì)胞中評(píng)估了反義寡核苷酸(ASO)的抗病毒活性。通過點(diǎn)印跡雜交（dot-blot hybridization）監(jiān)測(cè)細(xì)胞外 HBV DNA 水平，并通過中性紅色染料攝取評(píng)估毒性。
（ii）原代人肝細(xì)胞（PHH）：在第1天轉(zhuǎn)染反義寡核苷酸(ASO)，并在第二天用HBV（基因型D，MOI 500）感染細(xì)胞。 感染后第11天收集培養(yǎng)上清液和細(xì)胞，以定量HBV DNA（qPCR）和 HBsAg，HBeAg（ELISA）。
研究結(jié)果
使用螢光素酶測(cè)定法鑒定出了有效的嵌合反義寡核苷酸（CASOs），在 0.--5 nM 時(shí)表現(xiàn)出大于 75％ 的敲低。 通常，嵌合反義寡核苷酸（CASOs） 的效力比不含 SB 9000 的相應(yīng)反義寡核苷酸(ASO)效力高約10倍。與25％血清溫育后，SB 9000 在6小時(shí)內(nèi)從 CASO 上解離，所得的反義寡核苷酸(ASO)對(duì)核酸酶降解的抵抗能力長(zhǎng)達(dá)48小時(shí)。
反義寡核苷酸(ASO)還顯示出強(qiáng)大的 RNaseH 介導(dǎo)的互補(bǔ)RNA裂解。
在HepG2.2.15細(xì)胞中，兩個(gè)先導(dǎo)嵌合反義寡核苷酸（CASOs） SB 527 和 SB 539 降低了 HBV DNA水平，EC50值在 10 至 99 nM 之間（CC50> 500 nM）。
此外，SB 527 和 SB 539 在 PHH 分析中僅以低納摩爾 EC50 即可促使 HBV DNA 和病毒抗原（HBsAg和HBeAg）顯著降低。 SB 527 和 SB 539 的目標(biāo) mRNA 區(qū)與HBV基因型A-H的同源性> 98％。
綜上，研究發(fā)現(xiàn)這兩款主要的嵌合反義寡核苷酸（CASOs） SB 527 和 SB 539 通過 RNase H 介導(dǎo)的機(jī)制敲低HBV病毒轉(zhuǎn)錄物，在基于細(xì)胞的測(cè)定中被發(fā)現(xiàn)是有效的抗HBV藥物。 目前研究人員正在進(jìn)行進(jìn)一步的研究以開發(fā)主要的嵌合反義寡核苷酸（CASOs），從而寄希望能以聯(lián)合療法提高慢乙肝的功能性治愈率。（更多肝病新藥研究信息敬請(qǐng)關(guān)注“肝臟時(shí)間”微信公眾號(hào)）！
信息來源HepDART 2019大會(huì)論文集：Antisense oligonucleotides linked to the immunomodulatory dinucleotide SB 9000 are highly potent anti-HBV agents
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