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編者按：目前用于治療HBV感染的抗病毒藥物主要包括核苷和干擾素α兩大類，兩者合理聯(lián)用已可以實(shí)現(xiàn)臨床治愈。乙肝的完全治愈（包括cccDNA和整合HBV DNA的清除）還無法實(shí)現(xiàn)，實(shí)現(xiàn)完全治愈主要有兩種策略：一是通過安全清除受感染的肝細(xì)胞，這需要通過誘導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)來實(shí)現(xiàn)；二是通過清除cccDNA或永久沉默cccDNA轉(zhuǎn)錄。因此，基因編輯類藥物也成為了研發(fā)熱點(diǎn)，當(dāng)然機(jī)會(huì)和風(fēng)險(xiǎn)是并存的，基因編輯類藥物研發(fā)的難度也大，目前都僅在臨床前研究階段。

2022年9月，Beam Therapeutics在2022國(guó)際HBV會(huì)議上公布了在研乙肝基因編輯類新藥胞嘧啶堿基編輯器（CBE）的完整臨床前數(shù)據(jù)，CBE通過靶向cccDNA和整合HBV DNA可有效降低病毒生物標(biāo)志物并防止病毒反彈。

【新藥進(jìn)展】乙肝基因編輯新藥臨床前結(jié)果發(fā)布，離乙肝完全治愈還有多遠(yuǎn)？

技術(shù)背景

01 堿基編輯策略通過在HBV基因組中引入終止密碼子實(shí)現(xiàn)HBV治愈

CBE可以靶向HBV基因組的cccDNA和整合HBV DNA，在不引起雙鏈DNA斷裂（DSB）的情況下將特定DNA堿基直接、不可逆地轉(zhuǎn)化為另一個(gè)堿基，從而引入精確和永久的終止密碼子/錯(cuò)義突變，在達(dá)到沉默HBV基因的同時(shí)最大限度地減少染色體重排/缺失風(fēng)險(xiǎn)。

基于堿基編輯技術(shù)可以解決慢乙肝的兩個(gè)關(guān)鍵問題：1) 通過在cccDNA中引入永久性突變防止HBV反彈；2) 在無DSB的情況下，不可逆地沉默來源于整合HBV DNA的HBsAg表達(dá)。

02 CBE無需雙鏈斷裂即可將C-G轉(zhuǎn)換為T-A

轉(zhuǎn)換步驟：A：從DNA序列的目標(biāo)堿基對(duì)C : G開始；B：CBE由部分失活的CRISPR蛋白與脫氨酶融合而成，經(jīng)向?qū)NA（gRNA）引導(dǎo)至目標(biāo)基因組的DNA序列上并暴露出狹窄的編輯窗口；C：脫氨酶通過脫氨作用將靶胞嘧啶（C）化學(xué)修飾為尿嘧啶（U），Cas酶則在相反鏈上形成切口；D：尿嘧啶（U）被DNA聚合酶解讀為胸腺嘧啶（T），修復(fù)DNA鏈缺口，完成C : G到T : A堿基對(duì)的轉(zhuǎn)換。

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C-G轉(zhuǎn)換為T-A

臨床研究結(jié)果

01 BE4/gRNAs（S1 + C2）有效降低細(xì)胞模型中HBV相關(guān)標(biāo)志物并防止病毒反彈

BE4/gRNAs（S1 + C2）包含兩個(gè)gRNA，可引導(dǎo)堿基編輯器BE4同時(shí)靶向HBs（gRNA S1）和PreCore（gRNA C2）并在其DNA中引入終止密碼子。在HBV感染的人肝癌HepG2-NTCP細(xì)胞中，相比靶向無關(guān)基因PCSK9的BE4，BE4/gRNAs（S1 + C2）可導(dǎo)致HBV相關(guān)標(biāo)志物（HBsAg、HBeAg、HBV DNA、3.5kb RNA）的大幅降低；BE4/gRNAs（S1 + C2）聯(lián)合拉米夫定可使堿基編輯率提高20%，對(duì)HBV相關(guān)標(biāo)志物的抑制作用更明顯。進(jìn)一步研究表明，BE4/gRNAs（S1 + C2）通過編輯cccDNA發(fā)揮作用，并不降低cccDNA水平。

堿基編輯治療可降低HepG2-NTCP細(xì)胞中HBV相關(guān)標(biāo)志物

在原代肝細(xì)胞（PHH）中使用HBV DNA qPCR技術(shù)評(píng)估HBV病毒的復(fù)制，發(fā)現(xiàn)停用拉米夫定會(huì)導(dǎo)致HBV反彈，而停用BE4/gRNAs（S1 + C2）可防止病毒反彈。通過對(duì)cccDNA富集樣本的堿基編輯率進(jìn)行評(píng)估，發(fā)現(xiàn)經(jīng)BE4/gRNAs（S1 + C2）處理后約55%的HBs和80%的PreCore基因被成功編輯。

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不同藥物停藥后HBV DNA水平的變化

02 BE4/gRNA S1抑制自然整合HBV DNA的HBsAg表達(dá)

PLC/PRF/5細(xì)胞系是具有自然整合HBV DNA的肝癌細(xì)胞系，在第1天轉(zhuǎn)染BE4 mRNA和gRNA S1，第7天測(cè)定細(xì)胞外HBsAg水平。結(jié)果顯示BE4/gRNA S1可使約50%的HBs基因被編輯，細(xì)胞外HBsAg水平大幅降低。

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堿基編輯治療降低自然整合HBV DNA的HBsAg表達(dá)

03 BE4/gRNAs（S1 + C2）導(dǎo)致HBV小鼠模型中病毒標(biāo)志物的持續(xù)減少

HBV小鼠接受脂質(zhì)納米顆粒（LNP）遞送的BE4/gRNAs（S1 + C2）1劑或2劑作為試驗(yàn)組，BE4/PCSK9 1劑或2劑以及恩替卡韋口服兩周作為對(duì)照組。在第一次注射后第35天：BE4/gRNAs（S1 + C2）治療組HBsAg平均下降> 2 log，9只小鼠中有6只的HBsAg降至檢測(cè)限以下；BE4/gRNAs（S1 + C2）治療組血清HBV DNA持續(xù)降低> 3 log，2劑相比1劑對(duì)HBV DNA的抑制作用更強(qiáng)，停藥后未觀察到反彈；恩替卡韋治療也能抑制HBV DNA的復(fù)制，但停藥后DNA水平立即反彈；BE4/gRNAs（S1 + C2）治療組所有小鼠在第一次注射后兩周HBeAg水平降至最低檢測(cè)限以下。

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堿基編輯治療持續(xù)降低HBV小鼠模型中的病毒標(biāo)志物

總結(jié)

經(jīng)雙重堿基編輯技術(shù)在HBV基因HBs和PreCore中引入終止密碼子可有效降低細(xì)胞及小鼠模型中HBV相關(guān)標(biāo)志物如HBsAg、HBeAg、HBV DNA和3.5kb RNA水平，防止停藥后HBV的再激活。堿基編輯治療可能通過引入阻止HBV復(fù)制和沉默病毒蛋白表達(dá)的堿基突變，永久滅活cccDNA和整合HBV DNA，為實(shí)現(xiàn)慢乙肝的完全治愈帶來新的希望。

肝霖君有話說

由于HBV感染宿主后形成的cccDNA十分穩(wěn)定，且部分HBV DNA能整合到人類基因組中，導(dǎo)致對(duì)HBV的完全清除十分困難，慢乙肝的完全治愈至今未能實(shí)現(xiàn)。而基因編輯技術(shù)能直接靶向致病基因，在治愈許多難治性疾病包括慢乙肝方面展現(xiàn)出了巨大潛力。

目前針對(duì)慢乙肝的基因編輯藥物共有3個(gè)，均長(zhǎng)期處于臨床前研究階段。基因編輯藥物的研發(fā)同時(shí)也充滿了挑戰(zhàn)。首先是基因編輯效率問題，我們需要將基因編輯所需要的蛋白質(zhì)、酶、mRNA、gRNA等特異性遞送至受感染的肝細(xì)胞，繼而產(chǎn)生堿基轉(zhuǎn)換、基因敲入/敲除等以修復(fù)或沉默致病基因。但現(xiàn)有遞送載體的傳遞效率低下、載體容量小、靶向特異組織能力不足、基因編輯的工具酶效率低等都會(huì)導(dǎo)致基因編輯效率低，部分致病基因未能實(shí)現(xiàn)編輯從而無法完全清除病毒基因組，如本文中BE4/gRNA的堿基編輯率在50% - 80%之間，未實(shí)現(xiàn)100%編輯，進(jìn)而也未實(shí)現(xiàn)對(duì)所有研究對(duì)象HBsAg的徹底清除。其次是脫靶效應(yīng)，即除了編輯目標(biāo)基因以外，還可能識(shí)別非目標(biāo)區(qū)域但具有相似堿基序列的基因進(jìn)行編輯，從而改變正常的基因組。人類大約有2 - 3萬個(gè)基因，但整個(gè)基因組間的差異不足1%。要在如此多的基因中實(shí)現(xiàn)對(duì)特定基因的編輯難度較高，基因編輯的脫靶率也較高，從而引發(fā)一系列的不良反應(yīng)，嚴(yán)重時(shí)甚至可能危及生命，且目前也缺少能在全基因組范圍內(nèi)檢測(cè)脫靶的高靈敏方法，所以安全性將是阻礙基因編輯藥物發(fā)展的另一大難題。此外，基因編輯作為一種新興技術(shù)，目前還處于早期發(fā)展階段，基因編輯策略的優(yōu)化和過程控制都還需進(jìn)一步探索，前期藥物開發(fā)的經(jīng)驗(yàn)也十分匱乏，故相比傳統(tǒng)藥物在開發(fā)周期、人力、物力等方面耗費(fèi)更多，推進(jìn)也更難。

盡管基因編輯療法的開發(fā)困難重重，現(xiàn)階段人們對(duì)基因編輯技術(shù)的爭(zhēng)議頗多，但相信隨著眾多科研人員的深入研究與打磨，基因編輯有望被有效而安全地運(yùn)用于治病救人，造福世界。

在目前完全治愈還無法實(shí)現(xiàn)的情況下，應(yīng)積極追求臨床治愈以最低化遠(yuǎn)期不良結(jié)局風(fēng)險(xiǎn)，而不能盲目的等待新藥的上市。最近也有相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)相當(dāng)一部分臨床治愈的慢乙肝患者實(shí)現(xiàn)肝內(nèi)cccDNA清除，HBV整合顯著降低（相關(guān)鏈接）。因此是否通過更高敏的HBsAg檢測(cè)手段可以讓臨床治愈更接近完全治愈，這也是目前積極探索的課題（相關(guān)鏈接）。

參考文獻(xiàn)：

Smekalova E, Martinez MG, Combe E, et al. Cytosine base editing inhibits Hepatitis B Virus replication and reduces HBsAg expression in vitro and in vivo. 2022 International HBV Meeting.

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