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時間：2022-10-13 09:22:00
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編輯：乙肝新聞
編者按：近年來，國內外學者對慢乙肝的臨床治愈進行了大量探索研究，大型真實世界研究“珠峰項目”3.5年階段性數據結果顯示患者48周HBsAg清除率達33.2%（相關鏈接）。臨床治愈的持久性和遠期獲益已有非常多的循證醫學證據，但對于更進一步的關于完全治愈以及臨床治愈與完全治愈距離的探索目前還較少。
為了探討慢乙肝臨床治愈患者肝組織內cccDNA和整合HBVDNA水平及其與病毒學標志物的關系，探討其對臨床治愈后病毒學復發的預測價值，高志良教授團隊在JournalofClinicalandTranslationalHepatology上發表了相關研究，結果顯示慢乙肝患者獲得臨床治愈后肝內cccDNA水平和HBV整合顯著降低，并有27%的患者獲得了cccDNA清除，臨床治愈患者病毒學復發的風險很低，特別是出現cccDNA陰轉及HBsAb較高的患者。
研究方法
本研究分為兩部分，分別是關于抗病毒治療后肝內cccDNA的研究和HBV整合的研究。
第一部分共納入116例患者，其中經抗病毒治療后獲得臨床治愈的慢乙肝患者48例（臨床治愈組，FC組），未獲得臨床治愈的患者27例（非臨床治愈組，NFC組），以及初治慢乙肝患者41例（慢乙肝組，CHB組）作為陽性對照。臨床治愈組除3例患者為使用NAs單藥治療外，其余患者均為使用聚乙二醇干擾素α（PegIFNα）治療，獲得臨床治愈后停用PegIFNα。非臨床治愈組患者均為NAs單藥治療。所有患者均行肝活檢并接受肝內cccDNA及其他病毒標志物檢測。FC組至少隨訪24周觀察有無復發。
第二部分另外納入10例慢乙肝患者分析HBV整合情況，包括4例HBeAg陽性初治慢乙肝患者、3例HBeAg陰性初治慢乙肝患者和3例臨床治愈的患者。使用全基因組測序來尋找HBV整合位點。
患者特征
01 cccDNA研究的患者特征
三組之間的年齡和性別沒有差異。CHB組ALT水平顯著高于其他兩組（p<0.05），FC組和NFC組中未檢測到血清HBVDNA，CHB組的血清HBVDNA水平為5.8log10IU/mL。NFC組和CHB組均檢測到HBsAg，CHB組顯著高于NFC組（3.4vs.1.4log10IU/mL,p<0.05）。FC組pgRNA呈陰性，NFC組21例患者中有3例患者pgRNA陽性，CHB組39例患者中有38例pgRNA陽性，兩組平均水平分別為3.0和4.2log10copies/mL。FC和NFC組血清HBcrAg水平顯著低于CHB組（p<0.05）。FC組和NFC組分別有13例和3例患者的肝內cccDNA呈陰性，CHB組患者均檢測出肝內cccDNA。CHB組肝內cccDNA水平顯著高于其他兩組，FC和NFC組差異不顯著。
各組患者的人口學和病毒學特征
02 HBV整合研究的患者特征
共對10例患者展開全基因組測序，其中3例獲得臨床治愈患者的用藥策略為：
患者F808經ETV單藥治療38個月后，轉換為PegIFNα+ETV聯合治療12周，隨后接受PegIFNα單藥治療36周。PegIFNα單藥治療第12周時獲得HBsAg清除。
患者R228接受了13個月的TDF治療后轉換為PegIFNα+TDF聯合治療72周。聯合治療第44周時獲得HBsAg清除。
患者F807為慢加急性肝衰竭，經ETV治療22個月，在第8個月時獲得HBsAg清除。
這10例患者中有70%的家庭成員中至少有1位患有乙肝相關疾病。本研究檢測了10例患者的HBV基因型，最終發現5例B基因型和4例C基因型患者，與華南地區的優勢基因型一致（排除F807，因其缺少HBV基因序列）。
研究結果
一、cccDNA相關研究
01 臨床治愈后肝內cccDNA清除率為27%
48例臨床治愈的患者中有13例cccDNA檢測不到，清除率為27%，肝內cccDNA陽性和陰性患者的對數范圍為0.00365-1.54log10copies/cell和?2.44-0.19log10copies/cell，顯著低于CHB組（p<0.001）。根據cccDNA的狀態進一步將患者分為cccDNA陰性組和cccDNA陽性組。兩組在性別、年齡、乙肝病程、NAs治療史、干擾素類型、HBsAg清除時間等方面無顯著差異。cccDNA陽性組有乙型肝炎家族史的患者多于陰性組，但差異無統計學意義（45.7%vs.23.1%,p=0.145）。
cccDNA陰性和陽性組患者的人口學特征比較
02 肝內cccDNA陰性或HBsAb>100IU/mL的臨床治愈患者均未發生HBsAg逆轉
停藥后隨訪24周以上，48例HBsAg清除的患者中共有7例出現HBsAg逆轉（>0.05IU/mL），其中1例患者qHBsAg升高至0.05-1IU/mL，4例患者qHBsAg升高至1-20IU/mL，這5例均為HBVDNA陰性，另外2例病毒學復發的患者接受NAs治療并在24周時檢測不到HBVDNA。
肝內cccDNA陽性的患者中有20%（7/35）的患者發生HBsAg逆轉，而肝內cccDNA陰性的患者無HBsAg逆轉發生。HBsAb>100IU/mL的患者均未發生HBsAg逆轉。
臨床治愈慢乙肝患者的隨訪路線圖
5例HBsAg血清學逆轉且無病毒學復發患者的qHBsAg動態變化情況
二、HBV整合研究
01 超45%的整合位點位于蛋白質編碼基因中
10份肝組織樣本中共有439個病毒整合位點。HBeAg陽性CHB組、HBeAg陰性CHB組和FC組HBV整合位點數分別為132個、304個和3個。整合位點優先分布在第4和第11染色體上，位于X染色體上的整合位點少于預期。45.79%的整合位點位于蛋白質編碼基因中。啟動子被定義在轉錄起始位點上游5kb處。HBV整合不會優先定位在啟動子、外顯子、內含子和3'UTR，這影響基因表達。
HBV整合在人類基因組中的染色體分布
02 臨床治愈組患者的HBV整合數量顯著更低
在1例（33.3%）臨床治愈患者和所有慢乙肝患者的肝組織樣本中檢測出HBV整合。FC組患者的HBV整合數量顯著低于HBeAg陽性和HBeAg陰性CHB患者。分析顯示28%的斷點出現在HBV基因組的1500-1900nt位點，包括DR1和DR2這兩個位點，這兩個位點在將HBVDNA整合到宿主細胞基因組中起著關鍵作用。病毒基因組更傾向于附著在HBx的3'端附近和前核心區/核心區基因的5'端附近的斷點上，這可能會導致HBV整合。但是臨床治愈組的3個斷點都位于S/P區。本研究還發現39.64%的HBV片段通過≥2bp的微同源序列與人類基因組相連。
03 有的HBV整合位點位于肝癌驅動基因上，可能是肝癌發生的潛在風險
HBeAg陽性CHB組、HBeAg陰性CHB組和FC組分別有4個、23個和1個整合位點位于肝癌驅動基因上。在1例已經獲得臨床治愈的患者中，HBVDNA仍然整合在驅動基因上，這表明盡管患者已經獲得了臨床治愈，但HBV整合可能是肝癌發生的潛在風險。KEGG分析顯示整合基因在腫瘤相關通路富集。腫瘤通路提示，影響了致癌通路相關的整合基因的表達或功能可能是HBV整合的致癌因素。
04 機制分析：臨床治愈后復發風險低可能是由于cccDNA池變小或失活所致
本研究表明，在獲得臨床治愈后27%的慢乙肝患者cccDNA檢測不到。對于肝內cccDNA陽性的患者，其水平也顯著低于初治慢乙肝患者，更重要的是所有獲得cccDNA清除的患者均未發生病毒學復發，提示在目前的治療下是可以實現cccDNA清除的，這對于預測慢乙肝患者停藥后短期內是否復發至關重要。雖然有7例患者發生HBsAg血清學逆轉，但只有2例患者出現病毒學復發。所有HBsAg逆轉發生在cccDNA陽性組，這是因為轉錄和復制需要原始模板。該研究結果提示慢乙肝患者在獲得臨床治愈后復發風險非常低，可能是由于cccDNA池變小或失活所致。
肝霖君有話說
乙肝完全治愈的實現策略主要有兩個方向，一是在不殺死受感染肝細胞的情況下治愈乙肝，即清除cccDNA或永久沉默cccDNA轉錄；二是通過清除受感染肝細胞治愈乙肝，即是通過機體免疫功能的調節，讓免疫細胞活化，然后安全清除HBV感染細胞。已有多項研究從機制層面證實了干擾素α清除cccDNA的可能性（相關鏈接一、二、三），本研究結果表明，慢乙肝患者獲得臨床治愈后肝內cccDNA水平顯著降低，其中27%的患者獲得了cccDNA清除，同時，臨床治愈患者病毒學復發的風險非常低，特別是出現cccDNA陰轉及HBsAb較高的患者。可見，通過現有治療手段是有可能實現肝內cccDNA清除的。另外，獲得臨床治愈的患者的HBV整合數量顯著低于初治慢乙肝患者。
該研究中獲得臨床治愈的患者基本上來源于接受基于PegIFNα抗病毒治療的人群，可見該治療策略是理想的追求臨床治愈的方式。臨床治愈是目前可達到的最接近完全治愈的目標，但臨床治愈與完全治愈的距離如何，以及是否可以通過相關標志物進行判斷，還需要更深入的探索和研究。
參考文獻：
GanW,GaoN,GuL,etal.ReductioninIntrahepaticcccDNAandIntegrationofHBVinChronicHepatitisBPatientswithaFunctionalCure[J].JournalofClinicalandTranslationalHepatology,2022.
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【期刊導讀】干擾素降解HBV cccDNA的新機制：依賴于ISG20，與APOBEC3A協同作用
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